ISO 10993-23：2021 医疗器械生物相容性评价 第23部分：刺激试验
一、皮肤接触的动物刺激试验
◆采用适宜动物模型（首选动物免）评估待测材料产生皮肤刺激反应的可能性。
◆阳性试验要求：应证明试验的敏感性，能通过在试验中设置一组阳性对照来加以证实。
◆注1：适宜的阳性对照是SDS。
◆注2：一般情况下试验样品pH≤2.0或≥11.5，此材料应被认为是刺激物。
1.动物与管理
◆品种：健康、初成年的白化兔，雌雄不限
◆体重：不低于2 kg。
◆没数量：3只，如预期有刺激反应，初试应考虑使用1只动物。有出现明显的阳性反应时，应至少再使用2只动物进行试验。
◆其他条件：皮肤健康无损伤
◆如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。
◆使动物适应环境，并按GB/T16886.2/ISO 10993-2的规定饲养
皮肤试验步骤：
◆试验前4h~24h在动物背部脊柱两侧除去足够面积被毛。
2.粉末或液体样品
◆将0.5g或0.5ml的试验材料直接接触皮肤测试部位。固体和疏水性材料无需湿化处理粉剂使用前宜用水或其他适宜的介质稍加湿化。用2.5cmX2.5cm非封闭式的敷料（如吸水性纱布块）覆盖接触部位，然后用绷带（半封闭性或封闭性）固定敷贴片至少4h。
◆接触期结束后取下敷贴片并使用不会刺激皮肤的持久性记号笔对接触部位进行标记。用适当的方法除去残留试验材料，如用温水或其他适宜的无刺激性溶剂清洗并小心拭干。
3.浸提液和浸提介质
◆将相应的浸提液滴至2.5cmX2.5cm大小的吸水性纱布块上，浸提液的用量以能浸透纱布块为宜，一般每块纱布滴0.5ml。将滴有浸提介质的纱布块敷贴在对照接触部位。用绷带（半封闭性或封闭性）覆盖敷贴部位至少4h。
◆接触期结束后取下敷贴片，用非皮肤刺激性持久性记号笔对接触部位进行标记，并用适当的方法除去残留试验材料，如用温水或其他适宜的无刺激性溶剂清洗并小心拭干。
4.固体样品
◆将试验材料样品直接接触免脊柱两侧的皮肤。对照样品同法应用。检测固体物时（必要时可研成粉末），应使用水或必要时选择一种替代溶剂将试验材料充分湿化，以保证与皮肤良好的接触性。用2.5cmX2.5cm的非封闭性敷料（如纱布块）覆盖材料接触部位然后用绷带（半封闭性或封闭性）固定敷贴片至少4h。厚度近似实际使用要求但不超过0.5cm。
◆接触期结束后取下敷贴片，并使用不会产生皮肤刺激的持久性记号笔对接触部位进行标记。用适当的方法除去残留试验材料，如用温水或其他适宜的无刺激性溶剂清洗并小心拭干。
5.动物观察
◆单次接触试验时，分别在除去敷贴片后（1+0.1）h、（24+2）h、（48±2）h和（72±2）h记录各接触部位的情况。如存在持久性损伤，可能有必要延长观察时间，以评价这种损伤在不超过14d的时间内的可逆性或不可逆性。在延长的观察期内，应每天至少观察动物一次。
◆重复接触试验应仅在急性单次接触试验完成后进行[至少在观察（72±2）h后]。重复接触试验应根据器械临床使用设计。
◆在单次接触试验轻微反应后进行重复接触应对其进行论证。
◆重复接触试验时，每次在除去敷贴片后（1±0.1）h以及再次接触前立即记录接触部位的情况。接触次数能不同。末次接触后，分别在除去敷贴片后（1±0.1）h、（24±2）h、（48±2）h和（72±2）h记录各接触部位的情况。如有持久性损伤，可能有必要延长观察时间，以评价这种损伤在不超过14d的时间内的可逆性或不可逆性。在延长的观察期内，应每天至少观察动物一次。
6.皮肤反应记分系统
|
反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
|
|
无红斑 |
0 |
|
极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
|
清晰红斑 |
2 |
|
中度红斑 |
3 |
|
重度红斑（紫红色）至无法进行红斑分级的焦痂形成 |
4 |
|
水肿形成 |
|
|
无水肿 |
0 |
|
极轻微水肿（勉强可见） |
1 |
|
清晰水肿（肿起边缘清晰） |
2 |
|
中度水肿（肿起约1 mm） |
3 |
|
重度水肿（肿起超过1 mm并超出接触区） |
4 |
|
刺激最高记分 |
8 |
|
应记录并报告皮肤部位的其他异常情况。 |
|
7.结果评价
单次接触：
·在（72±2）h评分后，分别将每只动物试验样品和空白对照在（24±2）b、（48±2）h和（72±2）h引起的全部红斑与水肿记分相加，再将所有记分之和除以6（2个试验/观察部位，3个时间）计算出某一动物的原发刺激记分。
·将每只动物全部原发刺激记分相加后再除以动物总数即为原发性刺激记分。
·同法计算出对照原发性刺激记分。
·将试验样品原发性刺激记分减去对照原发性刺激记分，即得出原发性刺激指数
重复接触：
·按照上述方法计算每只动物原发性刺激记分，考虑全部评价终点。
·将全部动物刺激记分相加后再除以动物总数，该值即为累积刺激指数。
记录每只动物的任何反应。
兔原发性或累积性刺激指数类型：
|
评价记分 |
反应类型 |
|
0~0.4 |
极轻微 |
|
0.5~1.9 |
轻微 |
|
2~4.9 |
中度 |
|
5~8 |
重度 |
二、皮内（皮肤内）途径的动物刺激试验
对于接触破损或受损表面、外部接入或作为植入物使用的医疗器械，需使用皮内（皮肤内）反应性试验。在皮内注射该材料的浸提液后，评估被测物质产生刺激的可能性。
阳性试验要求：为确保试验的再现性和敏感性，每6个月使用相应浓度（低浓度诱导阳性刺激评分>1，避免导致皮肤坏死。）的十二烷基硫酸钠进行一次阳性验证试验，使用至少3只动物，在所有时间点，每只动物的5个氯化钠控对照点均应为0，在所有时间点上，每只动物的5个油对照均≤1。
注1：适宜的阳性对照是SDS。
注2：一般情况下试验样品pH≤2.0或>11.5，此材料应被认为是刺激物。
1.动物与管理
◆品种：健康、初成年的白化兔，雌雄不限
◆体重：不低于2 kg。
◆没数量：3只，如预期有刺激反应，初试应考虑使用1只动物。有出现明显的阳性反应时，应至少再使用2只动物进行试验。
◆其他条件：皮肤健康无损伤
◆如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。
◆使动物适应环境，并按GB/T16886.2/ISO 10993-2的规定饲养。
2.皮内试验步骤
◆试验前4h~18h在动物背部脊柱两侧除去足够面积被毛
◆脊柱一侧的5个点皮内注射0.2m极性或非极性浸提液
◆脊柱另一侧注射极性或非极性溶剂对照液
3.动物观察
◆注射后即刻并在24±2h、48±2h和722h观察记录各注射部位状况；
◆按给出的记分系统对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分；
◆在72±2h观察时，可静脉注射适宜的活体染料，如台盼蓝或伊文斯蓝；
◆油类液体皮内注射常会引发炎症反应，记分<1。
◆某些医疗器械（如真皮填充剂）能直接应用。由于真皮填充剂将保留在皮内，因此不宣将其与水肿相混淆。
4.皮内（皮肤内）反应记分系统
|
反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
|
|
无红斑 |
0 |
|
极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
|
清晰红斑 |
2 |
|
中度红斑 |
3 |
|
重度红斑（紫红色）至无法进行红斑分级的焦痂形成 |
4 |
|
水肿形成 |
|
|
无水肿 |
0 |
|
极轻微水肿（勉强可见） |
1 |
|
清晰水肿（肿起边缘清晰） |
2 |
|
中度水肿（肿起约1 mm） |
3 |
|
重度水肿（肿起超过1 mm并超出接触区） |
4 |
|
刺激最高记分 |
8 |
|
应记录并报告皮肤部位的其他异常情况。 |
|
5.结果评价
◆在（72±2）h评分后，分别将每只动物试验样品或空白对照的（24±2）h、（48±2）h和（72±2）h的全部红斑与水肿记分相加，再除以15[3（记分时间点）X5（试验样品或空白对照注射点）]，计算出每只动物试验样品或空白对照的记分。
◆每一试验样品和相应空白对照的总平均记分：3只动物记分相加÷8
◆试验样品最终记分=试验样品平均记分-空白对照平均记分
判定标准：
如试验样品最终记分不大于1.0，则符合该试验要求；
三、眼刺激试验
目的：评估试验材料产生眼刺激反应的可能性
在皮肤试验中已证实有明显腐蚀性或有重度刺激性的材料和/或最终产品不应再进行眼刺激试验。
任何显示为皮肤刺激物或pH≤2.0或≥11.5的材料也不宜再进行试验，宜标示为潜在的眼刺激物
1.动物与管理
◆品种：健康、初成年的白化兔，雌雄不限。
◆体重：不低于2 kg。
◆数量：3只，初试应使用1只动物评价试验材料。如1只动物出现清晰的阳性反应时，则不必再进行试验。使用预期不会引起显著眼部刺激的材料，例如隐形眼镜溶液、表征良好的、无细胞毒性的材料或其他材料，通过科学判断，可以一开始就测试3只兔子，不需要单免筛选。
◆如试验使用了至少3只动物后反应仍然疑似或不明确，应考虑进行复试。使动物适应环境，并按GB/T16886.2/IS010993-2的规定饲养
2.试验材料
◆试验材料如是液体，将0.1mL未稀释液直接滴入动物1只眼的下结膜囊内。
◆试验材料如是固体或颗粒状制品，将其研成细粉，混合后取0.1m体积容量（质量不超过100 mg）滴人动物1只眼的下结膜囊内。
◆注：有的产品不适宜直接在眼中试验，机械损伤能导致试验无效。
◆如将试验材料装人泵中喷射，可像液体样喷射滴人0.1mL。
◆如将试验材料装人喷雾器中，可选择下列方法中的一种：1.在距离张开的眼睛10cm处喷射1s；2.或喷人一冷容器内凝结为液体后应用。
◆如试验材料只能用其浸提液进行试验，将0.1m的浸提液滴入动物1只眼的下结膜囊内。在上述同等条件下不加试验材料，用极性和非极性溶剂制备空白液。
3.实验步骤
◆在试验开始前24h内，目视检查每只兔子的双眼，判断是否有眼部异常的情况。如果任何1只眼睛有任何异常，就应更换免子。
◆检查眼时可使用2%荧光素钠（英国药典）或等同试剂检查角膜损伤，也推荐使用检眼镜、手持式裂隙灯或其他适宜的设备。
◆按规定将试验样品滴入动物的1只眼内。滴注后将眼睑闭合约1s。测试浸提液时，每只动物的对侧眼睛作为对照，宜用空白液体或空白对照处理。如材料预期要反复接触人体，并且在急性试验中未发现有显著反应时，可进行重复接触试验。
◆重复接触试验应只在急性接触试验完成后[至少在（72±2）h后]进行，接触周期宜与试验材料/器械临床使
4.动物观察
◆对一次性滴人试验材料的动物，在滴注后约（1±0.1）h、（24±2）h、（48±2）h和（72±2）h检查每只动物的双眼。
◆如有持续性损伤存在，有必要延长观察时间，以确定损伤的进展性和可逆性，但延期不超过21d。
◆对多次滴人试验材料的动物，在每次滴注前和滴注后（1±0.1）h检查每只动物的双眼如末次滴注后有刺激现象，可能要延长观察时间。如有持续性角膜受累症状或其他眼刺激反应也可能需要延长观察时间，以确定损伤的进展性和可逆性。主要涉及：角膜浑浊程度受累范围，虹膜，结膜充血水肿分泌物。对有严重损伤的动物延期观察是不合理的。
5.结果评价
急性接触：如果有1只以上动物试验眼在任何观察阶段呈现阳性结果，即认为该材料为眼刺激物，不必进一步试验。
如3只动物试验眼中仅有1只呈轻度或中度反应或是疑似反应，另取动物进行复试。复试中如动物试验眼在任何观察阶段半数以上呈现阳性结果，则认为该试验材料为眼刺激物。
仅有1只动物出现严重反应已足以标示该材料为眼刺激物。重复接触：如试验组中半数以上动物在任何观察阶段呈现阳性结果，即认为该试验材料为眼刺激物。
观察记分系统
|
反应 |
记分 |
|
1.角膜 |
|
|
混浊程度（观察最致密混浊区域）： |
|
|
透明 |
0 |
|
云翳或弥散混浊区，虹膜清晰可见 |
1* |
|
易识别的半透明区，虹膜清晰可见 |
2* |
|
乳白色区，看不见虹膜，勉强可见瞳孔 |
3* |
|
混浊，看不见虹膜 |
4* |
|
角膜受累范围 |
|
|
大于0，小于或等于1/4 |
0 |
|
大于1/4，小于1/2 |
1 |
|
大于1/2，小于3/4 |
2 |
|
大于3/4直至整个角膜区域 |
3 |
|
反应 |
记分 |
|
2.虹膜 |
|
|
正常 |
0 |
|
超出正常皱襞，充血水肿，角膜缘充血（其中一种或全部）仍有对光反应（反应迟为阳性） |
1* |
|
无对光反射，出血性严重结构破坏（其中一种或全部） |
2* |
|
3.结膜 |
|
|
反应 |
|
|
充血（累及脸结膜和球结膜，不包括角膜和虹膜） |
|
|
血管正常 |
0 |
|
血管明显充血 |
1* |
|
弥散性充血，呈深红色，血管纹理不清 |
2* |
|
弥散性充血，呈紫红色 |
3* |
|
水肿 |
|
|
无水肿 |
0 |
|
轻微水肿（包括瞬膜） |
1* |
|
明显水肿伴部分睑外翻 |
2* |
|
眼睑水肿使眼呈半闭合状 |
3* |
|
眼脸水肿使眼呈半闭合乃至全闭合状 |
4* |
|
分泌物 |
|
|
无分泌物 |
0 |
|
超过正常分泌量（不包括正常动物眼内眦少星分泌物） |
1 |
|
分泌物浸湿眼睑临近邻近睫毛 |
2 |
|
分泌物浸湿眼脸，睫毛和眼周围区域 |
3 |
四、口腔黏膜剌激试验
目的：评估试验材料对口腔组织产生刺激的可能性
任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不应再进行试验，应标示为潜在的口腔组织刺激物。
1.动物与管理
◆品种：应使用同一品系任一性别的健康、初成年金黄色地鼠。
◆数量：6只动物（3只样品，3只对照）。
◆注：另取动物用相应的阴性对照材料或空白液处理可能是合适的
使动物适应环境，并按GB/T 16886.2/IS0 10993-2的规定饲养
2.试验步骤
翻转每只动物颊囊。用生理盐水冲洗后，检查有无异常。
对于固体试验材料，直接将样品（直径不大于5mm）放人频囊内。
对液体试验材料或浸提液样品，则可用棉球浸透样品，记录吸收的体积，放入动物的一侧颊囊内。也可将适宜体积的样品直接灌注人颊囊。
另一侧颊囊不放样品作为对照。如有必要，可使用阴性对照动物按照对照程序进行平行试验。
必要时，重新给动物带上项圈放回笼中。
接触时间应与材料预期实际使用时间一致，但不能少于5min。
接触后除去项圈和棉球，用生理盐水冲洗颊囊，注意不要污染另一侧颊囊。
对于急性接触，每小时（±0.1h）重复上述步骤，共4h。其他处理方案（如基于临床使用）应进行论证并记录。
重复接触试验时，根据预期临床应用情况确定接触次数、持续时间和间隔时间。
3.动物观察
取出棉球后肉眼观察颊囊，并且在每次接触前（如需重复接触时）检查颊囊。描述动物颊囊的一般状况，并按表给出的记分系统判定动物每一观察期颊囊表面红斑反应记分。记录结果以出具试验报告。
|
反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
-- |
|
无红斑 |
0 |
|
极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
|
清晰红斑 |
2 |
|
中度红斑 |
3 |
|
重度红斑（紫红色）至焦痴形成 |
4 |
|
宜记录并报告组织的其他不良改变 |
|
4.结果评价
比较试验侧颊囊与对侧颊囊，如有对照组，与对照组动物的颊囊进行比较。每一观察记分相加后再除以观察总数得出每只动物平均记分。
末次接触后（24±2）h肉眼观察颊，人道处死地鼠。取颊囊有代表性部位的组织样品，放入适宜的固定液中固定后进行组织学检查。
（1）应由病理学家对口腔组织显微镜下的刺激作用进行评价，可按表规定的记分系统对每一组织进行评分。（2）试验组中所有动物的显微镜评价记分相加，再除以观察总数，得出试验组平均记分。对照组同法计算。最大记分为16。（3）对照颊囊或对照动物的显微镜评价总分大于9时，表明有病理改变，可能是试验操作时造成的损伤。如其他试验或对照动物出现同样的高分，无论是哪种情况，可能都有必要进行复试。（4）试验组平均记分减去对照组平均记分得出刺激指数。
|
反应 |
记分 |
|
1.上皮 |
- |
|
正常，完好无损 |
0 |
|
细胞变性或变扁平 |
1 |
|
组织变形 |
2 |
|
局部糜烂 |
3 |
|
广泛糜烂 |
4 |
|
2白细胞浸润（每个高倍视野） |
- |
|
无 |
0 |
|
极少（少于25） |
1 |
|
轻度（26-50） |
2 |
|
中度（51-100） |
3 |
|
重度（大于100） |
4 |
|
3血管充血 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
|
重度伴血管破裂 |
4 |
|
4水肿 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
|
重度 |
4 |
|
平均记分 |
反应程度 |
|
0 |
无 |
|
1-4 |
极少 |
|
5-8 |
轻度 |
|
9-11 |
中度 |
|
12-16 |
重度 |
五、阴茎刺激试验
目的：评估试验材料产生阴茎皮肤刺激反应的可能性。
任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不应再进行试验，应标示为潜在的阴茎刺激物。
|
反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
|
|
无红斑 |
0 |
|
极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
|
清晰红斑 |
2 |
|
中度红斑 |
3 |
|
重度红斑（紫红色）至无法进行红斑分级的焦痂形成 |
4 |
|
宜记录并报告组织的其他不良改变 |
|
1.动物与管理
◆品种：健康、初成年的白化兔。
◆体重：不低于2 kg。
◆数量：6只。
◆其他条件：供试验接触的阴茎长度应至少为1cm。由于动物个体色素差异，首次试验前应先观察动物，按表D.2给出的记分系统对红斑进行评分，不应使用出现严重变色或红斑记分大于或等于2的动物。
◆如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。
使动物适应环境，并按GB/T 16886.2/IS0 10993-2的规定饲养
2.实验步骤
用辅助器具固定动物四肢，使动物保持仰卧姿势。
用食指和中指轻压外阴部使阴茎伸出。
阴茎伸出后，施用足够的试验样品（约0.2ml）以确保覆盖阴茎。
使阴茎缩回包皮中，并应采取措施（如伊丽莎白颈圈）防止动物舔试验部位，以避免继发性因素干扰原发性刺激反应。或者，试验材料末次接触后，动物也可固定在一个设计合理的固定器中（1±0.1）h。
对于急性接触，每小时（±0.1h）重复上述步骤，共4h。其他处理方案（如根据临床使用情况）应进行论证并记录。
长期重复接触试验时，根据预期临床应用情况确定试验接触次数、持续时间和间隔时间。
3.动物观察
急性接触时，每次接触后（1±0.1）h（如下次接触前立即）注意观察阴茎外观。末次接触后（1±0.1）h、（24±2）h和（48±2）h观察并记录阴茎外观。
长期重复接触时，在首次接触后（1±0.1）h和下次接触之前观察记录阴茎外观。
按表给出的记分系统对每一动物每一观察期皮肤表面红斑反应记分，并记录结果以出具试验报告。动物在试验前如有皮肤发红现象，应从试验样品红斑记分中减去试验前的红斑记分，以确定由试验样品引起的红斑记分。每一观察记分最高为4分。
|
反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
|
|
无红斑 |
0 |
|
极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
|
清晰红斑 |
2 |
|
中度红斑 |
3 |
|
重度红斑（紫红色）至焦痂形成 |
4 |
|
宜记录并报告组织的其他不良改变 |
|
4.结果评价
将试验阴茎和包皮与对照动物阴茎进行比较。
将每次观察记分相加后再除以观察次数得出每只动物的平均记分。
48h观察后立即将动物人道处死。切下阴茎和包皮末端放入适宜的固定剂中固定后进行组织学检查。
（1）应由病理学家对阴茎皮肤的刺激作用进行评价，病理学家可根据表给出的系统对每个组织进行记分。（2）将试验组所有动物的显微镜评价记分相加，加和除以观察动物个数，得到试验组平均值。最大记分为16。对照组同法计算。（3）对照动物出现显微镜评价总记分大于9时，表明可能有操作损伤。如其他试验或对照动物显示同样的高分时，可能有必要进行复试。
试验组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数
对于长期重复接触试验，可将表修改为适合于对有关慢性刺激额外的组织反应的评价。
|
反应 |
记分 |
|
1.上皮 |
- |
|
正常，完好无损 |
0 |
|
细胞变性或变扁平 |
1 |
|
组织变形 |
2 |
|
局部糜烂 |
3 |
|
广泛糜烂 |
4 |
|
2白细胞浸润（每个高倍视野） |
- |
|
无 |
0 |
|
极少（少于25） |
1 |
|
轻度（26-50） |
2 |
|
中度（51-100） |
3 |
|
重度（大于100） |
4 |
|
3血管充血 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
|
重度伴血管破裂 |
4 |
|
4水肿 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
|
重度 |
4 |
|
平均记分 |
反应程度 |
|
0 |
无 |
|
1-4 |
极少 |
|
5-8 |
轻度 |
|
9-11 |
中度 |
|
12-16 |
重度 |
六、直肠刺激试验
目的：评估试验材料产生直肠组织刺激反应的可能性。
任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH<2.0或≥11.5的材料不应再进行试验，应标示为潜在的直肠刺激物。
1.动物与管理
品种：健康、初成年的白化兔。雌雄不限。
◆体重：不低于2 kg。
◆数量：6只。
◆其他条件：每次试验操作前应检查动物直肠排液、水肿和/或其他感染、刺激和/或损伤迹象。
◆如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。
◆使动物适应环境，并按GB/T 16886.2/IS0 10993-2的规定饲养
2.试验步骤
将一短软管（6cm）或一钝头插管与一容量大于1m1的注射器连接，注射器和导管注满后给予动物1mL试验样品。应为每只动物分别准备1套注射器和连接导管。将动物置于固定器中固定，以便于接触会阴部位，或用固定器具将动物束缚住后再固定其后肢，以暴露出会阴部位。
导管插入前用对照样品或适当的润滑剂湿化处理。提起动物尾巴暴露出会阴，然后将湿化处理过的导管轻柔地插入直肠，用注射器注入1mL试验液。抽出导管并以适当的方法处置掉。由于动物个体直肠容积的差异性，试验样品注人时或注人后可能会有溢出，用软纸巾轻柔拭去溢出的液体。
每次间隔（24±2）h重复上述步骤，连续5d。其他处理方案（如基于临床使用）应进行论证并记录。
对于长期重复接触试验，应根据预期临床接触时间确定接触次数、持续时间和间隔时间。
3.动物观察
初次接触后（24±2）h和每次试验操作前注意并记录会阴部位溢液、红斑和刺激状况。对于出现过度溢液、肿胀或难以给药的动物，应人道处死后做组织学检查。
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反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
|
|
无红斑 |
0 |
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极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
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清晰红斑 |
2 |
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中度红斑 |
3 |
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重度红斑（紫红色）至焦痂形成 |
4 |
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宜记录并报告组织的其他不良改变 |
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4.结果评价
末次接触后（24±2）h无痛处死动物，完整切下直肠后纵向剖开，检查上皮组织层的刺激、损伤以及坏死情况。将直肠和大肠的末端放入适当的固定剂中固定后进行组织学检查。将试验兔的直肠组织与对照免直肠组织进行比较。记录并描述肉眼观察下每只动物直肠组织的状况，注意试验与对照部位之间的差别。
（1）应由病理学家对直肠组织的刺激作用进行评价，病理学家可根据表给出的系统对每个组织进行记分。（2）将试验组所有动物的显微镜评价记分相加，加和除以观察动物个数，得到试验组平均值。最大记分为16。对照组同法计算。（3）对照动物出现显微镜评价总记分大于9时，表明可能有操作损伤。如其他试验或对照动物显示同样的高分时，可能有必要进行复试。
试验组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数。
对于长期重复接触试验，可将表修改为适合于对有关慢性刺激额外的组织反应的评价。
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反应 |
记分 |
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1.上皮 |
- |
|
正常，完好无损 |
0 |
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细胞变性或变扁平 |
1 |
|
组织变形 |
2 |
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局部糜烂 |
3 |
|
广泛糜烂 |
4 |
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2白细胞浸润（每个高倍视野） |
- |
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无 |
0 |
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极少（少于25） |
1 |
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轻度（26-50） |
2 |
|
中度（51-100） |
3 |
|
重度（大于100） |
4 |
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3血管充血 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
|
重度伴血管破裂 |
4 |
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4水肿 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
|
重度 |
4 |
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平均记分 |
反应程度 |
|
0 |
无 |
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1-4 |
极少 |
|
5-8 |
轻度 |
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9-11 |
中度 |
|
12-16 |
重度 |
七、阴道刺激试验
目的：评估试验材料产生阴道组织刺激反应的可能性。
任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不应再进行试验，应标示为潜在的阴道组织刺激物。
1.动物与管理
◆品种：健康、初成年的雌白化兔。动物应无育并未孕。
◆体重：不低于2 kg。
◆数量：6只。
◆其他条件：每次试验操作前应检查动物阴道溢液、水肿和/或其他感染、刺激和/或损伤迹象。在动物发情期阶段也应检查阴道，以避免由于阴道的生理变化而作出假阳性反应判定
◆如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。
◆使动物适应环境，并按GB/T 16886.2/IS0 10993-2的规定饲养
2.试验步骤
将一短软管（6cm）或一钝头插管与一容量大于1ml的注射器连接，注射器和导管注满后给予动物1mL试验样品。应为每只动物分别准备1套注射器和连接导管。将动物置于固定器中固定，以便于接触阴道，或用固定器具将动物束缚住后再固定其后肢，以暴露出阴道。
导管插入前用对照样品或适当的润滑剂湿化处理。提起动物尾巴暴露出阴道口，然后将湿化处理过的导管轻柔地插人阴道，用注射器注人1mL试验样品。抽出导管并以适当的方法处置掉。由于动物个体阴道容积的差异性，试验样品注入时或注人后可能会有溢出，用软纸中轻轻拭去溢出的液体。
每次间隔（24±2）h重复上述步骤，至少连续5d。其他处理方案（如基于临床使用）应进行论证并记录。
对于长期重复接触试验，应根据预期临床应用情况确定接触次数、持续时间和问隔时间。
3.动物观察
初次接触后（24±2）h和每次试验操作前注意并记录阴道口和会阴部位溢液、红斑和水肿迹象。
对于出现过度溢液、红斑和/或水肿情况，或难以给药的动物，应无痛处死后做组织学检查。
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反应 |
记分 |
|
红斑和焦痂形成 |
|
|
无红斑 |
0 |
|
极轻微红斑（勉强可见） |
1 |
|
清晰红斑 |
2 |
|
中度红斑 |
3 |
|
重度红斑（紫红色）至焦痂形成 |
4 |
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宜记录并报告组织的其他不良改变 |
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4.结果评价
末次接触后（24±2）h人道处死动物，完整切下阴道后纵向剖开，检查上皮组织层的刺激，损伤以及坏死迹象。
将取下的阴道组织放入适当的固定剂中固定后进行组织学检查。每块阴道组织应取其两端和中央三部分。
将接触过试验材料的动物阴道与对照动物的阴道进行比较。记录并描述肉眼观察下每只动物阴道组织的状况，注意试验组与对照组之间的差别。
（1）应由病理学家对阴道组织的刺激作用进行评价，病理学家可根据表给出的系统对每个组织进行记分。（2）将试验组所有动物的显微镜评价记分相加，加和除以观察动物个数，得到试验组平均值。最大记分为16。对照组同法计算。（3）对照动物出现显微镜评价总记分大于9时，表明可能有操作损伤。如其他试验或对照动物显示同样的高分时，可能有必要进行复试。
试验组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数。
对于长期重复接触试验，可将表修改为适合于对有关慢性刺激额外的组织反应的评价。
|
反应 |
记分 |
|
1.上皮 |
- |
|
正常，完好无损 |
0 |
|
细胞变性或变扁平 |
1 |
|
组织变形 |
2 |
|
局部糜烂 |
3 |
|
广泛糜烂 |
4 |
|
2白细胞浸润（每个高倍视野） |
- |
|
无 |
0 |
|
极少（少于25） |
1 |
|
轻度（26-50） |
2 |
|
中度（51-100） |
3 |
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重度（大于100） |
4 |
|
3血管充血 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
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重度伴血管破裂 |
4 |
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4水肿 |
- |
|
无 |
0 |
|
极少 |
1 |
|
轻度 |
2 |
|
中度 |
3 |
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重度 |
4 |
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平均记分 |
反应程度 |
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0 |
无 |
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1-4 |
极少 |
|
5-8 |
轻度 |
|
9-11 |
中度 |
|
12-16 |
重度 |
